Þekkt er að kæling frumna (32-36°C) eykur tjáningu fáeinna þekktra gena. Margt
er á huldu um þá innanfrumu- og millifrumuferla sem kæling snertir við og
kallaðir hafa verið kælisvarið. Kæling er notuð í læknisfræðilegum tilgangi til að
fá fram taugaverndandi áhrif hjá sjúklingum sem hafa orðið fyrir miklum
taugaskaða, svo sem eftir hjartastopp eða vegna súrefnisþurrðar í fæðingu.
Kælivísar (mild hypothermia indicators (MHI)) voru búnir til en þeir segja til um
tjáningu þriggja gena (SP1, CIRBP, RBM3) sem þegar eru þekkt að því að gegna
hlutverki í kælisvarinu. Kælivísarnir voru nýttir við framkvæmd skimana fyrir
áhrifaþáttum kælisvarsins. Kælivísarnir sýna mestu svörunina við 32°C í
mismunandi frumulínum, og þeir hafa takmarkaða virkni við hátt hitastig (40°C)
og lágt hitastig (˂30°C), en þetta bendir til sértækni kælivísanna. Framkvæmdar
voru þrenns konar skimanir fyrir þáttum sem hafa áhrif á kælisvarið; lyfjaskimun,
CRISPR-Cas9-stökkbreytiskimun og ENU-stökkbreytiskimun. Auk þess var RNA-mengi
kældra og ókældra frumna úr músum raðgreint, bæði frá frumum úr heilum
lífverum og ræktuðum músafrumum.
Við framkvæmd skimana var SP1+MCRE-MHI kælivísirinn notaður í leit að virkjun
kælisvarsins meðal 1953 lyfja. Tvö lyf (Poziotinib og Entacapone) fundust sem
bæði virðast geta virkjað kælisvarið. Næst voru kælivísarnir, SP1-MHI og LentiRBM3-MHI, notaðir með framsýnni CRISPR-Cas9-stökkbreytiskimun til þess að
finna gen sem virkja eða bæla kælisvarið. Við fundum mörg gen sem virðast
geta virkjað eða bælt kælisvarið en eitt þeirra gena sem bælir kælisvarið,
SMYD5 skoðuðum við frekar. SMYD5 færir metýlhópa á histón sem gegnir
hlutverki í stjórnun genatjáningar. Utangenaerfðamerki eru þekktir miðlar
hitastigsáhrifa á erfðamengi í öðrum lífverum. Í óháðu gangasetti sést að við
37°C er SMYD5 bundið við stjórnraðir SP1 og CIRBP en ekki við stjórnröð RBM3.
Á sama stað og SMYD5 bindst við erfðamengið kemur H3K36me3
utangenaerfðamerkið fram. Ef SMYD5 er slegið út má sjá aukningu SP1 og
CIRBP við 37°C með próteinmagnmælingu og einnig sjáum við aukningu á
virkjun SP1-MHI kælivísins við 37°C og 32°C. SMYD5 minnkar við 32°C í
mannafrumum og heila músa ásamt SMYD5 bindingu við erfðamengið í
mannafrumum. Við framkvæmdum framsýna ENU stökkbreytiskimun á músum, til
þess að finna gen sem valda afbrigðilegri hitastigsstjórnun við kæliáreiti. Fyrstu
niðurstöður þeirrar skimunar lofar góðu og hafa listar verið birtir yfir þau gen
sem hugsanlega valda afbrigðilegri hitastigsstjórnun í lífverum.
v
Einnig var RNA raðgreining framkvæmd á taugastofnfrumum úr músum í rækt
við 37°C og 32°C, og frumum úr dreka ásamt heilaberki músa sem annars vegar
höfðu innra hitastig 37°C og hins vegar innra hitastig við 32°C. Í ljós kom að
mörg gen breyta tjáningu sinni við kælingu. Þrjátíu og sjö önnur gen fundust
sem SMYD5 virðist bæla við 37°C og haga sér því á svipaðan máta og SP1.
Þetta verkefni hefur aukið skilning á kælisvari spendýrafrumna, en mörg gen
breyta tjáningu sinni við kælingu eða hafa áhrif á grunnlíkamshitastig lífvera eftir
kælingu. Í þessari doktorsritgerð kemur fram hvernig kæling fyrir tilstuðlan
utangenaerfða, getur haft áhrif á genatjáningu. Einnig fundust tvö lyf sem
mögulega geta haft áhrif á kælisvörun, en það býður upp á frekari möguleika til
rannsókna á lyfjameðferðum hjá sjúklingum sem þurfa á kælimeðferð að halda.
In humans, the expression of several genes is increased with mild hypothermia
(32-36°C), however, the precise nature of this mild hypothermia response (MHR)
is unknown. In clinical practice MHR is often utilized as a neuroprotective agent
in catastrophic events such as after neonatal hypoxic ischemia and cardiac arrest.
In this thesis there were several methods used to gain deeper understanding of
some of the characteristics of the MHR. To study these effects there were created
and validated arrays of fluorescent mild hypothermia indicators (MHI) which
measure regulatory activity of three genes (SP1, CIRBP, RBM3) which have
previously been shown to be part of the MHR. The MHIs show maximum
activation at 32°C in diverse cell systems with limited response in hyperthermia
or moderate hypothermia (˂30°C), which indicates specificity. Here, three different
types of screens were performed; a drug screen, CRISPR-Cas9 KO (knock out)
mutagenesis screen and an ENU mutagenesis screen. RNA-Sequencing of in vivo
and in vitro mouse cells that had been exposed to hypothermia was also
performed.
To gain further insight into the MHR the MHIs were utilized for two of three
different screening strategies. The SP1+MCRE-MHI was used to look for MHR
activation after medication exposure to 1953 FDA-approved compounds. This
yielded two agents (Poziotinib and Entacapone) that could activate the MHR.
Next, a forward CRISPR-Cas9 mutagenesis screen was combined with two MHIs,
SP1-MHI and Lenti-RBM3-MHI, to identify a list of potential activators/repressors
of SP1 and RBM3. Which led to the identification of numerous activators and
repressors, including the repressor SMYD5 which was studied further. SMYD5 is
a histone methyltransferase known to play a role in gene regulation. In other
species, histone modifications as well as epigenetic regulators are used to
integrate temperature cues into regulatory networks. Independent datasets show
temperature (37°C) dependent SMYD5 binding at promoters of both SP1 and
CIRBP but not RBM3. At the site of SMYD5 genomic binding there is an
overlapping H3K36me3 modification peak. SMYD5 expression and genomic
binding decreases at 32°C in vivo and in vitro, as quantified by Western blotting,
CUT&RUN and Immunofluorescence. Next, a dominant ENU mutagenesis screen
was performed to look for genes that cause abnormality in core temperature
under hypothermic stimulus. The first results are promising, and this thesis
vii
provides a list of candidate genes that could cause core temperature
abnormality, although the list needs further validation.
RNA-Sequencing was performed of in vitro mouse Neural Progenitor cells
(mNPCs) at 37°C and 32°C as well as RNA-sequencing of in vivo mouse
hippocampal and cortical cells that had their core temperature either kept at
37°C or lowered to 32°C. There are many genes that have altered expression
under hypothermic conditions. A list of additional 37 temperature responsive
genes were identified; these genes seem to be regulated in a similar
temperature dependent manner as SP1 and CIRBP by SMYD5.
This project expands the current knowledge of the mild hypothermia pathway in
mammalian cells and mammals. Here in this thesis, there is a mammalian
example provided of how the epigenetic machinery incorporates the influence of
environmental cues into the genome of mammalian cells. Also, potential novel
therapeutic avenues for targeted temperature management/therapeutic
hypothermia are identified.
Læst til 05.04.2034